上海橋星生物

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一、胰蛋白酶（trypsin）溶液

    胰蛋白酶是白色或淡黃色粉末，低溫干燥保存。主要作用是使細胞間的蛋白質水解，使細胞離散。其活性以其消化酪蛋白的能力進行測定。常用1:250（1:500）方法表示，即1份胰蛋白酶可以消化250份（或500份）酪蛋白。

胰蛋白酶對細胞的分離作用與細胞的類型和細胞的性質關系密切。不同細胞系對胰蛋白酶溶液的濃度、溫度和作用時間等的要求也不相同。

    無鈣鎂離子的平衡鹽溶液（常用于配制胰蛋白酶溶液或用于洗滌細胞）

    NaCl    8g

    KCl    0.20g

    KH2PO4    0.02g

    Na2HPO4    0.073g

    葡萄糖    2.00g

    酚紅    0.02g

    溶于1000ml水中

    染色體的G帶核型實驗中胰蛋白酶用生理鹽水配制。

二、EDTA溶液

    又稱versene，一般用其鈉鹽，因可溶性較好。有些組織需要Ca2+、Mg2+來保持其完整性，用EDTA來排除這些離子，可使細胞之間裂解，以分散細胞。其作用比胰蛋白酶緩和。使用濃度為0.02%，以無鈣、鎂的平衡鹽溶液配制。

    實驗室內常將胰蛋白酶和EDTA聯(lián)合使用。可提高消化效率，細胞分散情況改善。

EDTA不能被血清抑制，所以消化后必須*清洗。

EDTA對成纖維細胞作用差。

三、膠原酶溶液

    1．用Hank's液配制成2000U/ml

    2．36.5度攪拌溶解1h，4度過YE

    3．濾過消毒

    4．分裝成等份使用（1-2周內）

    5．長時間貯存在-20度

四、貼壁細胞——消化法——細胞懸液

    1．吸除或倒掉瓶內培養(yǎng)液。

    2．以25cm2培養(yǎng)瓶為例，向瓶內加入1ml消化液（胰蛋白酶或與EDTA混合液）輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細胞表面，然后吸掉或倒掉消化液后再加1ml消化液，輕輕搖動后再倒掉大部分消化液，僅留少許進行消化。也可不采用上述步驟，直接加1-2ml消化液進行消化，但要注意盡量減少消化液的剩余量，因為消化液過多對細胞有損傷，同時也需要較多的含血清培養(yǎng)液去中和。

    3．消化在37度或室溫25度環(huán)境下進行。消化2-5分鐘后把培養(yǎng)瓶放置在顯微鏡下進行觀察，發(fā)現(xiàn)胞質回縮、細胞間隙增大后，應立即終止消化。

    4．如僅用胰蛋白酶可直接加含血清的培養(yǎng)液，終止消化。

       如用EDTA消化，需加Hank's液數(shù)毫升，輕輕轉動培養(yǎng)瓶把殘留EDTA消化液沖掉，然后再加培養(yǎng)液，這個操作過程要十分小心，如果細胞已經脫壁則消化液不能夠倒掉，以免丟失細胞，要加入Hank's液或培養(yǎng)液終止消化，吹打收集細胞懸液，離心漂洗去除EDTA。

    5．用彎頭吸管，吸取瓶內培養(yǎng)液，反復吹打瓶壁細胞，吹打過程要順序進行，從培養(yǎng)瓶底部一邊開始到另一邊結束，以確保所有底部都被吹到。吹打時動作要輕柔不要用力過猛，同時盡量不要出現(xiàn)泡沫，這些都對細胞有損傷。細胞脫離瓶壁后形成細胞懸液。